丝素蛋白纳米羟磷灰石支架的实验研究

应用共混法制备了纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架材料,通过体外降解和细胞培养实验研究了复合支架材料的降解特性和生物相容性.体外降解实验结果显示,复合支架材料具有稳定的降解能力;在降解过程中,羟基磷灰石由于与降解液发生钙、磷等离子的交换,使其结晶得到了进一步生长和完善.利用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐(mtt)比色法和碱性磷酸酶(alp)活性测定等分析了复合支架材料的生物相容性,结果表明,mg63细胞在复合支架材料上具有良好的粘附、增殖能力,并可引起早期的骨分化.因此,纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架作为骨组织工程的支架材料具有良好的应用前景。

为了探讨丝素蛋白/羟基磷灰石(sf/ha)复合多孔支架材料的制备及其用于骨缺损的修复,采用超声波凝胶干燥法制备了sf/ha复合材料;以脱胶茧丝为增强材料,水溶性淀粉为制孔剂,通过去离子水萃取法除去淀粉,制备了sf/ha多孔复合材料。对其孔隙率及抗压强度进行测试,并将其植入兔股骨缺损处观察修复的情况。sf/ha多孔复合材料的孔隙率接近75%,孔径尺寸分布约从几微米到400μm,并且孔隙之间相互贯通,其抗压强度可达10mpa以上,植入兔股骨缺损处未见引起骨组织明显的炎症反应及骨坏死,术后12周发现基本修复骨缺损部位,而空白对照组没有骨生成。sf/ha多孔复合材料可以满足骨组织工程支架的基本要求,用于骨缺损的修复。

以蚕丝丝素蛋白(sf)作为羟基磷灰石(ha)沉积的模板,制备ha/sf复合粉末,用扫描电镜(sem)、热重分析(tga)、x射线衍射(xrd)和傅立叶变换红外光谱(ft-ir)对复合粉末进行分析和鉴定。结果表明,合成产物是ha/sf复合物,其平均粒径约为275.7nm,其中丝素蛋白含量为17.8%(质量分数)。复合粉末经等静压成型后能够制得弯曲和压缩强度分别为19.87mpa和28.65mpa的ha/sf复合材料,以nacl为致孔剂能够制得平均孔径约为61μm、孔隙率为40%的多孔ha/sf复合材料。

再生丝素蛋白具有良好的生物相容性,羟基磷灰石同时还具有成骨诱导性。通过将再生丝素蛋白制备形成丝素蛋白多孔材料,并在37℃下将其浸渍于模拟体液中可以制备再生丝素蛋白/羟基磷灰石多孔复合材料。扫描电镜研究发现在再生丝素蛋白多孔材料的孔隙中羟基磷灰石由针状晶体聚集而成,红外光谱和xrd等表征表明复合材料中羟基磷灰石以羰基取代的羟基磷灰石存在。制备的再生丝素蛋白/羟基磷灰石多孔材料有望作为骨组织修复材料使用。

利用氯化钙-乙醇-水(n(cacl_2):n(etoh):n(h_2o)=1:2:8)三元溶液对丝素蛋白纤维预处理,再采用交替浸渍法将其分别浸在钙溶液和磷溶液中交替浸渍、仿生矿化制备丝素蛋白纤维/磷灰石复合材料,采用sem、ftir、xrd和tga等技术研究了不同预处理时间对丝素蛋白纤维微结构和构建丝素蛋白纤维/磷灰石的影响.结果表明,预处理增加了丝素蛋白纤维表面粗糙程度及内部孔隙率,并使钙离子与丝素蛋白纤维中的羧基、羟基和酰胺基等基团先发生作用,可以有效地提高磷灰石在丝素蛋白表面的沉积量,使得预处理后的丝素蛋白纤维与磷灰石的结合更均匀、密实,获得了磷灰石晶体沿c轴取向生长的仿骨结构的复合材料.

目的评价丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料的生物相容性。方法体外研究将成骨样细胞株mg-63细胞与不同材料进行复合培养,利用倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐比色(mtt)法进行生物相容性评价;体内研究将不同材料植入新西兰大白兔股骨髓腔,分别在4周、8周取出标本,he、新三色染色后观察新骨生成情况。结果在体外、体内实验中丝素蛋白-羟基磷灰石类骨质复合生物材料组均显示出良好的生物相容性。结论丝素蛋白-羟基磷灰石复合生物材料具有良好的生物相容性,为新型骨替代材料的制备及应用提供新的思路。

为了改善羟基磷灰石(hap)的脆性和新骨诱导性,采用共沉淀法合成hap,盐溶法制备丝素蛋白(sf),在胶体状态下将hap和sf复合得到了sf/hap复合材料。采用扫描电镜(sem)、x射线衍射(xrd),傅立叶红外光谱(fir)对复合材料结构和化学组成进行了分析,在模拟体液中检验了复合材料的生物活性,并对其抗压强度进行了测定。结果表明:hap与sf在纳米尺度进行了复合,复合材料中sf主要以β-折叠构象存在,酰胺ⅴ红外特征峰消失,β-折叠构象的其他峰发生了移动,表明hap与sf间存在化学结合;模拟体液中浸泡18天后,复合材料表面形成了片层状的hap;与纯的hap晶体比较,复合材料结构稳定,具有较好生物活性和骨诱导性,其抗压强度可达63mpa,可望成为理想的骨组织替换和工程支架材料。

通过静电纺丝法制备出纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维,利用扫描电镜、红外光谱仪、x射线衍射仪对纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维形貌和结构进行表征,并进行了拉伸测试。结果表明,随着超细纤维中羟基磷灰石含量的增加,纤维的直径逐渐降低,纤维中聚己内酯的结晶逐渐变差。相比于丝素蛋白/聚己内酯超细纤维,含有质量比为30%羟基磷灰石的复合超细纤维仍具有较好的力学性能。体外小鼠成纤维细胞(l929)培养表明,纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维对细胞没有毒性。

采用硝酸钙-丝素蛋白溶液与磷酸钠原位合成纳米羟基磷灰石(ha),在反应过程中丝蛋白(sf)诱导ha晶体生长,仿生合成ha/sf复合材料,用tem、ir、tga、xrd和sem进行表征。结果表明,ha为co23-部分替代型,粒径为10nm~40nm之间的弱结晶类骨晶体,在形貌和结晶度等方面与人体骨磷灰石相似。ha/sf复合材料中丝蛋白的含量约为25%,ha和sf两相存在强烈化学键合作用。sem观察结果表明,ha微粒被sf完全包裹,两者之间没有明显相分离。

目的比较复合不同剂量血管内皮生长因子(vegf)的纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合骨(nhac)修复骨缺损的效果。方法将纳米羟基磷灰石粉末和胶原蛋白粉末按8∶2的比例混合制备nhac人工骨,再将混合粉末与含10ng、100ng、300ngvegf的蒸馏水按1∶1.8的质量比调和制备nhac/vegf人工骨。建立大鼠双侧桡骨0.5cm缺损动物模型30只,按随机原则分为5组。以nhac/10ngvegf、nhac/100ngvegf、nhac/300ngvegf人工骨植入骨缺损处进行修复作为实验组,以nhac人工骨植入组及空白组作为对照组。术后2、4、8周各组行组织学及免疫组织化学检查,观察材料早期血管化及成骨情况。结果各时间点组织学评分以及血管计数均为nhac/300ngvegf人工骨组最高,于其他各组比较差异有统计学意义。各实验组血管数量在4周时达到高峰,而nhac组血管数量在8周时最多。结论血管内皮生长因子能明显促进nhac早期血管化及新骨形成,比单纯应用nhac能更好的修复骨缺损,并且随着vegf剂量的增加,新生血管数量和新骨形成量均相应增加。

目的:探讨纳米羟基磷灰石复合重组人骨形成蛋白-2人工骨(nano-ha/rhbmp-2)的骨缺损修复能力,为临床骨缺损修复提供依据。方法:采用新西兰大白兔75只,单侧桡骨制备骨缺损动物模型,以nano-ha/rhbmp-2复合人工骨植入骨缺损处进行修复作为实验组(a组),以nano-ha人工骨(b组)及空白组(c组)作为对照组;术后4周、8周、12周分别行大体标本观察、x线、扫描电镜(sem)、放射性核素骨扫描(ect)及生物力学测试,综合评价nano-ha/rhbmp-2复合人工骨对骨缺损的修复能力及对机体的影响。结果:nano-ha/rhbmp-2复合人工骨、nano-ha人工骨均可促进新骨形成,前者新骨形成量大,骨缺损修复能力明显优于后者,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:nano-ha/rhbmp-2复合人工骨具有良好的骨缺损修复能力,可望成为一种理想的骨缺损修复材料。

系统分析了羟基磷灰石(ha)的制备方法和丝素蛋白纤维(sf)的溶解方法,提出一种制备纳米丝素蛋白/羟基磷灰石生物复合材料(sf/ha)的新型反应复合方法——"一步法"。并对由"一步法"制得的sf/ha分别进行了钙磷比测定、红外光谱测试、透射电镜观察和x射线衍射测试。结果表明:sf/ha中的钙磷比是1.6692,与标准ha中的钙磷比1.67一致;sf/ha中同时含有sf和ha中各自的官能团;sf/ha的晶粒横向尺度小于100nm,sf/ha呈针状或柱状晶粒,sf和ha能够形成复合;sf/ha的晶型属于六方晶系,当sf在sf/ha中所占质量分数为10%时,晶胞参数a=b=9.0319,c=7.0148,沿c轴方向平均晶粒尺寸是230.7645。"一步法"制备sf/ha具有合理性和可行性。

羟基磷灰石(ha)是骨组织中无机物的主要成分。利用丝胶蛋白(ss)良好的生物相容性、生物降解性、细胞相容性,以及含有的羧基和羟基能与ca2+紧密结合的特点,将氢氧化钙和磷酸以湿法合成的羟基磷灰石按一定的比例加入到浓缩后的丝胶蛋白溶液中,经冷冻干燥制备成丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料,期望用于骨替代和骨缺损修复。对丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料进行扫描电镜(sem)、x射线衍射(xrd)、红外吸收光谱(ftir)、热力学性能以及力学性能等检测,并探讨不同原料配比对材料结构与性能的影响。结果表明,丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的孔隙分散均匀,孔隙率33.0%～62.5%;支架材料中的ha呈弱结晶态,与人体骨组织中ha的晶体态相似,丝胶蛋白分子呈β折叠结构;随着复合支架材料中ha的比例不断增加,材料的热分解温度提高,热学性能改善,当ha的质量分数达到50%时,弹性模量增大到15.64mpa,呈现较好的结构性能。

提出了一种制备ha/sf复合粉末的新方法.以磷酸氢二钠、无水氯化钙和丝素蛋白为原料制备羟基磷灰石/丝素蛋白(ha/sf)复合粉末,通过x-射线衍射(xrd)、扫描电子显微镜(sem)和红外吸收光谱(fir)等检测手段,探讨了反应酸度、反应温度、反应时间,丝素蛋白加入量和原料加入顺序对制备ha/sf复合粉末的影响,确定了最佳的制备条件;该方法可降低溶解丝素蛋白的温度,达到节约能源的目的.

以饱和ca(oh)2上清液、磷酸和胶原蛋白为原料,在36～39℃、ph=8～9条件下,用共滴定法制备纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架材料。用xrd、sem、tem、ir对材料的晶相结构、结晶程度、化学键结构、微观形貌、晶粒大小进行分析。结果表明:复合材料由低结晶度的纳米羟基磷灰石(5nm×60nm～20nm×100nm)和胶原蛋白纤维组成,二者之间形成了紧密键合。

纳米羟基磷灰石复合材料是一种新型骨组织替代或修复材料。介绍了羟基磷灰石的特性、合成方法，总结了改性研究及应用，阐述了纳米羟基磷灰石复合材料生物相容性。

本文以氢氧化钙悬浮液和磷酸为主要实验原料,在室温25℃,ph值为11的条件下,用共滴定的方法合成羟基磷灰石。把羟基磷灰石粉与一定量的胶原蛋白溶液混合,经过物理发泡、冷冻、微波干燥的过程,得到羟基磷灰石/胶原蛋白多孔支架材料。运用xrd、sem分析仪器和阿基米德原理及杠杆原理,对样品进行了检测。结果表明用物理发泡法制得的多孔支架材料的总气孔率为79%～89%,抗压强度为0.3～1.1mpa。

随着骨组织工程学研究的逐步深入,人工骨移植材料的研究得到全新的发展。骨组织工程应用于骨缺损修复的价值己被人们接受,其中支架材料研究是骨组织工程的核心内容和中心环节。羟基磷灰石(ha)是公认的性能良好的人工骨材料,大量的生物相容性实验证明羟基磷灰石无毒、无刺激、不破坏生物组织,并能与骨形成牢固的化学结合具有很好的生物

由纳米羟基磷灰石(ha)与丝素蛋白(sf)复合而成的新型生物复合材料,具有优良的生物相容性,已被研究用作骨移植及填充材料,但其由丝素蛋白分子内交联导致的较差的力学性能,限制了该复合材料的应用。本研究中,采用一种名为聚乙二醇二缩水甘油醚(pgde)的交联剂对复合材料中的丝素蛋白进行改性。该改性的复合材料经过一系列的检测,结果显示交联剂pgde可以提高丝素蛋白的结晶性,复合材料ha/sf的抗压强度提高了100%,且该交联剂并没有影响复合材料的生物相容性。

了解丝素蛋白(silkfibroin,sf)表面修饰的羟基磷灰石(hydroxyapatite,ha)修复骨缺损过程中,实验动物血液流变学和骨缺损修复区血流量的变化。选择20只新西兰白兔,制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型,根据植入不同移植材料分为实验组和对照组,实验组于动物左侧桡骨缺损区植入mscs复合sf表面修饰的ha培养制备的组织工程骨,对照组植入mscs复合ha培养制备的组织工程骨,观察各组动物术后7、14d血液流变学和术后14d骨缺损修复区血流量的变化。实验组与对照组比较,血液流变学指标和骨缺损修复区血流量差异显著,实验动物全身血液粘度降低,骨缺损修复区的局部血流量增加。sf表面修饰对以ha为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。

近年来,随着组织工程的深入研究,骨组织工程受到学者越来越多的重视。目前,骨组织工程的研究重点集中在支架材料、种子细胞、骨构建的相关生长因子等三个方面。纳米羟基磷灰石(nanohydroxyaptite,nhap)属于陶瓷类材料,有利于人体骨组织的修复、整合及改善植入组织的力学性能,因其优良的生物性能而备受关注,nhap已作为骨

目的探讨多聚蛋白多糖(aggrecan)过表达载体修饰骨髓间充质干细胞(bmscs)来源外泌体联合丝素蛋白支架对新西兰大白兔软骨缺损的修复作用。方法培养兔源性bmscs,流式细胞仪检测第2代bmscs表面蛋白cd44、cd29、cd34和cd45表达。慢病毒aggrecan过表达质粒转染bmscs,超速离心法提取外泌体,westernblot方法检测外泌体分子标志物cd81和cd63的表达。构建丝素蛋白支架联合外泌体复合物,利用扫描电镜技术检测丝蛋白支架的结构。利用苏木精-伊红(he)染色和番红-快绿染色检测新西兰大白兔软骨缺损模型中软骨结构。结果第2代bmscs表面蛋白cd44和cd29表达分别为60.2%和58.3%,cd34和cd45表达分别为3.4%和2.6%。慢病毒aggrecan过表达载体转染效率为(95±2)%。扫描电镜观察显示,外泌体为直径40～100nm双层膜的膜状结构。westernblot检测显示,外泌体可以表达分子标志物cd81和cd63。he染色和番红-快绿染色结果显示,aggrecan过表达载体修饰bmscs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用明显优于bmsc组和阴性对照组(f=19.298、12.548,p<0.05)。结论aggrecan过表达载体修饰bmscs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复具有明显的促进作用,可为骨性关节炎治疗提供新的思路与方法。