PLGA型胶原复合支架用于组织工程化骨再造的研究

以冷冻干燥和纳米合成技术制备生物玻璃和胶原复合支架材料,采用扫描电镜观察、红外光谱分析、差示扫描量热分析、热重分析、弯曲强度测试等分析手段,对复合支架的理化性能进行研究。研究结果表明:制备的支架具有多孔结构。在制备过程中,两相间产生了化学键合作用。由此论证了复合支架的孔隙结构可为细胞生长及细胞外基质的产生提供充分的空间。两相间的键合作用对于提高骨支架材料的热稳定性能、力学性能,减弱植入体内后在体液中的膨胀和浸析反应具有至关重要的作用。

目的本实验根据不同材料的生物学及力学性能,设计研制出合适的复合胶原蛋白生物支架。为临床中应用组织工程学方法修复关节软骨损伤提供相应的理论依据及一定实验基础。方法1.ⅰ型胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸钠等为主材料,制作复合膜,并冷冻干燥后化学交联等制作一种复合蛋白结构的生物材料。2.进行理化性能的研究以及细胞毒实验。结果所制备的复合材料的抗拉强度检测显示:平均可达到5.17×106帕斯卡;酸碱度检测:样品ph值与对照组差值均小于1.5;复合材料平均溶胀率=94.0%(n=3);孔隙率平均为80%以上;细胞毒性实验显示细胞毒性碳二亚胺小于戊二醛。结论复合材料理化指标结果符合体内植入物要求,该可以作为组织工程研究中的一种支架材料。

目的依据仿生原理制备纳米骨框架材料。方法以胶原分子为模板,调制钙磷盐在液相中沉积其上,得到矿化胶原基复合材料,并采用液相分离法与少量聚乳酸复合进一步制备成为三维多孔框架材料。分离成骨细胞并在三维框架材料上培养,用x-ray、衍射扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜进行观察和分析。结果胶原基纳米晶钙磷盐复合材料的晶粒度较低,晶体极为细小,与天然骨类似;材料为多孔状,孔隙率较高;内部为典型的纤维束状结构,该纤维束有ha晶体的衍射图样,且具有犤002犦择优取向;成骨细胞可在其上贴附、生长和繁殖。结论仿生制备的三维胶原基纳米骨框架材料,无论从结构还是性能上,都是骨组织工程中的优选材料之一。

背景:研究证实,壳聚糖及其衍生物可作为骨损伤的填充材料以及骨组织工程支架材料,但壳聚糖降解缓慢且不可控制的特性限制了其在骨组织工程中广泛应用。目的:评估羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架对兔腓骨损伤的修复作用。设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2007-06/2008-03在清华大学生物科学与技术系生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成。材料:以羧甲基壳聚糖和纳米胶原纤维为基础材料,模拟骨的结构设计制备了双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架。方法:选择成年新西兰大白兔10只,按随机数字表法分为3组,阴性对照组2只,壳聚糖支架组4只,复合支架组4只。制备兔腓骨10mm的损伤,分别以旷置缝合、植入壳聚糖支架、植入双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架处理各组。主要观察指标:扫描电镜观察支架微观形貌。术后12周,检测损伤部位的再生情况,以四环素荧光和vonkossa染色检测实验动物骨损伤部位新生骨钙化情况。结果:10只兔均进入结果分析。①扫描电镜观察到外层致密光滑的壳聚糖膜和多孔的中心区域,多孔区域有大量纳米胶原纤维网络结构填充。其孔径分布的峰值为60～100μm,孔隙率大于85%。②手术后12周,不脱钙切片的四环素染色,可发现阴性对照组两个断端间还没有连上,依旧以游离端存在。复合支架组移植物中形成多个大的钙化岛,其中心网状材料已经大部分降解,钙化岛分布在整个支架的内部区域;而壳聚糖支架组,材料基本没有降解,未见钙化区域。③vonkossa银染色显示,复合支架组动物骨损伤的中心区域,出现染成黑色的钙化区,中间夹杂着中性红复染的骨组织细胞。壳聚糖支架组动物没有明显的钙化区,多为组织细胞充斥在材料的孔隙中,可见材料基本没有降解。结论:双层羧甲基壳聚糖/纳米胶原纤维复合支架植入动物体内12周后,未见明显的炎症反应和坏死,降解明显,能够促进骨修复,是很有前景的骨组织工程用支架材料。

纳米羟基磷灰石（nhap）是一种性能优良的骨修复材料,但由于其脆性大、强度低而限制了它在承力部位的应用。nhap与其他材料复合可以提高材料生物相容性和力学性能,具有更大的临床应用前景。现就各种nhap复合支架的种类,以及nhap复合材料与骨形态发生蛋白、骨髓间充质干细胞复合来构建组织工程化骨的研究现状进行简要综述。

软骨的修复是当前医学界十分棘手的难题,人们采取若干手段均收效甚微。由于软骨缺损时,其下的软骨下骨常出现硬化、退变,而新生软骨是无法与病变的软骨下骨进行整合的,所以在修复软骨的同时,必须重视软骨下骨的修复。近十几年来,人们开始发明和利用各种骨软骨复合支架,进行同时修复软骨与软骨下骨的动物实验研究。在正常骨软骨组织中,软骨与软骨下骨被钙化层所相连,此外钙化层也将软骨与软骨下骨分隔在不同的生存环境中。根据仿生学原理,人们又设计出一种带有隔离层的新型骨软骨复合支架,并取得了较为理想的实验结果。本文就国内外骨软骨复合支架的研究进展作一综述。

目的比较复合不同剂量血管内皮生长因子(vegf)的纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合骨(nhac)修复骨缺损的效果。方法将纳米羟基磷灰石粉末和胶原蛋白粉末按8∶2的比例混合制备nhac人工骨,再将混合粉末与含10ng、100ng、300ngvegf的蒸馏水按1∶1.8的质量比调和制备nhac/vegf人工骨。建立大鼠双侧桡骨0.5cm缺损动物模型30只,按随机原则分为5组。以nhac/10ngvegf、nhac/100ngvegf、nhac/300ngvegf人工骨植入骨缺损处进行修复作为实验组,以nhac人工骨植入组及空白组作为对照组。术后2、4、8周各组行组织学及免疫组织化学检查,观察材料早期血管化及成骨情况。结果各时间点组织学评分以及血管计数均为nhac/300ngvegf人工骨组最高,于其他各组比较差异有统计学意义。各实验组血管数量在4周时达到高峰,而nhac组血管数量在8周时最多。结论血管内皮生长因子能明显促进nhac早期血管化及新骨形成,比单纯应用nhac能更好的修复骨缺损,并且随着vegf剂量的增加,新生血管数量和新骨形成量均相应增加。

目的在体外模拟微重力条件下构建心肌细胞-胶原复合体,探索组织工程化心肌组织体外再造的可行性。方法采用顺序消化及差速贴壁法从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,并将其与多孔胶原复合形成复合体。复合体在旋转生物反应器(rotarycellculturesystem,rccs)中进行培养,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和常规培养的复合体进行比较。结果在rccs中培养的复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与静止培养的复合体细胞相比,细胞代谢更加旺盛。结论采用组织工程技术可以在rccs中培育出组织工程化心肌组织。

关节软骨的解剖结构比较特殊,极易引起损伤。同时,组织修复能力较差。怎样对关节软骨缺损进行修复,这是骨科长期以来的研究热点之一。在修复领域,学者大多通过组织工程方法模拟某种损伤结构。本研究将探讨新型生物支架材料一包埋载生长因子纳米微球的医用聚氨酯/脱细胞软骨支架与骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞(bmscs)复合后修复关节软骨缺损的效果。1材料与方法1.1组织工程化骨的制备:(1)骨髓间充质干细胞:运用密度梯

以饱和ca(oh)2上清液、磷酸和胶原蛋白为原料,在36～39℃、ph=8～9条件下,用共滴定法制备纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架材料。用xrd、sem、tem、ir对材料的晶相结构、结晶程度、化学键结构、微观形貌、晶粒大小进行分析。结果表明:复合材料由低结晶度的纳米羟基磷灰石(5nm×60nm～20nm×100nm)和胶原蛋白纤维组成,二者之间形成了紧密键合。

中国组织工程研究第20卷第16期2016–04–15出版 chinesejournaloftissueengineeringresearchapril15,2016vol.20,no.16 p.o.box10002,shenyang110180www.crter.org2412 ·研究原著· www.crter.org 庄颖，男，1979年生， 贵州省凯里人，侗族， 2011年解放军第三军医 大学毕业，博士，主治医 师，主要从事脊柱相关疾 病的基础及临床研究。 通讯作者：徐永清，教授， 博士生导师，解放军成都 军区昆明总医院全军骨 科中心/干细胞与组织器 官工程研究中心，云南省 昆明市650032 中图分类号:r318 文献标识码:a 文章编号:2095-4344 (2016)16-02412-06 稿件接受

支架的研究一直是骨组织工程研究的主要问题之一。到目前为止已经开发出了不少比较成熟的支架制作技术。但是这些技术都还存在一定的缺陷。快速成形技术由于具有快速性和高度柔性的突出优点,因而在支架制造方面具有广泛的应用前景。清华大学已经在这个方面进行了大量的基础性研究。

背景:临床试验证明纳米晶胶原基骨支架材料具有较好的组织相容性、合适的孔隙率及降解性能,但缺乏缓释生长因子的作用,且无成骨诱导性。目的:将聚乙稀吡咯啉酮与骨形态发生蛋白复合后形成复合颗粒,再修饰纳米晶胶原基骨制备复合支架,观察骨形态发生蛋白的体外缓释效果。方法:实验分3组,实验组取冻存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm纳米晶胶原基骨1块,滴加聚乙稀吡咯啉酮混匀,-4℃冻存过夜,再滴加骨形态发生蛋白溶液,真空抽干后冻存;对照组1取冻存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm纳米晶胶原基骨1块,滴加骨形态发生蛋白溶液,真空抽干后冻存;对照组2取冻存管2支,每支放入5mm×5mm×5mm未脱钙的大鼠松质骨1块,滴加聚乙稀吡咯啉酮混匀,-4℃冻存过夜,再滴加骨形态发生蛋白溶液,真空抽干后冻存。观察14d,采用elisa法检测3组复合物骨形态发生蛋白的体外释放活性。结果与结论:观察到14d时,两对照组骨形态发生蛋白a值趋近于0,而实验组上清液中骨形态发生蛋白仍保持较高的a值,组间比较差异有显著性意义(p<0.05)。表明经聚乙烯吡咯烷酮修饰后纳米晶胶原基骨支架具有明显缓释骨形态发生蛋白的作用。

将介孔生物活性玻璃(mbg)与脱钙骨(db)复合,利用浸渍法制备出mbg/db复合支架材料.采用红外光谱(ftir),扫描电镜(sem),x射线衍射(xrd),电子万能材料试验机等方法对牛松质骨(cb)、db、mbg/db复合支架进行表征.结果表明,cb经浸酸处理后制备的db,孔径大小在200～600μm范围内,孔隙率约为71%,抗压性能比cb明显降低(1.10±0.31)mpa,而采用浸渍法制备的复合支架,孔隙率降为40%左右,而压缩强度明显提高(8.49±2.14)mpa.体外生物活性测试表明:复合支架具有良好的生物活性.

几种骨组织工程复合支架材料在模拟生理溶液中的生物矿化性能比较

通过体外模拟天然骨生物矿化和材料自组装的形成机制,研究制备了类骨羟基磷灰石/胶原仿生复合材料并对材料进行了表征。结果表明:纳米羟基磷灰石均匀分布在胶原基质上并择优取向排列,该复合材料的成分和微观结构与天然骨类似。

背景:在口腔组织工程学中,由于颌面骨形态复杂,不规则,而且颌骨支撑着颜面部,与容貌有很大的关联。这就提出了更高要求,不但要恢复功能而且要恢复原有形态,而且精密的修复形态将成为今后发展的趋势。目的:探讨透明质酸钠与复合重组人骨形态发生蛋白2诱导兔骨髓基质干细胞体外构建组织工程化骨修复上颌骨牙槽嵴缺损,并覆盖个性化钛模板作为外支架维持新骨塑形的可能性。方法:体外培兔骨髓基质干细胞,进行成骨诱导,复合透明质酸钠、重组人骨形态发生蛋白2构建组织工程化骨,植入自体牙槽嵴缺损处,外加个性化钛模板,术后4,8,12周处死动物分别进行x射线、常规组织学检查,观测组织工程化骨在体内成骨作用。以缺损区植入回收自体骨屑者为对照组。结果与结论:术后第4周,实验组与对照组新生骨灰度值差异有显著性意义(p0.05),术后4周与术后8周,术后8周与术后12周新生骨灰度值存在显著性差异(p<0.05)。常规组织学染色显示,在术后4周时,实验组成骨作用逊色于对照组。当生长到第8周时,两组成骨基本无显著差异。说明此法构建的组织工程化骨在体内成骨效应显著,个性化钛模板起到屏障塑形作用,促进新骨按特定形状生成。

目的:本文研制热触发自组装型羟基磷灰石(hydroxyapatite,ha)/胶原复合材料并测定了其理化特性。方法:采用相交融合法(interdigitation-fusion,if)制备载ca2+或pi脂质体,考察其包封率及相变温度。提取i型鼠尾胶原,与脂质体混合成前驱液,观察前驱液37℃时的显微结构及矿物质形成情况。结果:发现脂质体平均包封率为68%,前驱液34～35℃时开始形成ha/胶原复合体。因此提示前驱液在体温下可形成ha/胶原复合凝胶,可为新的根尖屏障材料提供方向。

目的探讨双层壳聚糖(chitosan,cs)/hap复合支架作为骨软骨组织工程支架的可行性,并结合兔自体bmscs修复骨软骨缺损。方法采用冻干法和烧结法制作双层cs/hap复合支架,检测其理化特性。取日本大耳白兔骨髓4～6ml,全骨髓培养法分离纯化bmscs,并鉴定。调整第2代bmscs细胞密度为2×107个/ml,应用纤维蛋白胶种植技术,接种至双层cs/hap复合支架,体外构建细胞-支架复合物。取36只日本大耳白兔,于右侧膝关节股骨下端外侧髁负重区,作一直径4mm、深3mm的圆柱形缺损,制备兔膝关节骨软骨缺损模型。根据缺损区植入物的不同,分为a、b、c3组(n=12)。a组:植入细胞-支架复合物;b组:植入双层cs/hap复合支架;c组:不植入任何材料,作为空白对照组。术后6、12周取材,行大体及组织学观察,采用改良wakitani法评分。结果双层cs/hap支架cs层孔隙率为76.00%±5.01%,孔径为200～400μm,平均300μm,孔洞相通;hap层孔隙率为72.00%±4.23%,孔径为200～500μm,平均350μm,孔洞相通,结合部结合好。全骨髓法培养bmscs,第7天可见集落形成,14d传代;免疫组织化学检测示cd44(+)和cd45(—)。大体观察和组织学检测显示,a组基本修复软骨缺损,骨缺损修复不良,有骨小梁长入;b、c组骨、软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维组织或无新生组织形成,软骨及骨缺损均明显存在。术后6、12周,a组改良wakitani评分分别为(5.17±1.17)分和(3.20±0.75)分,均优于b、c组,差异有统计学意义(p<0.05)。结论双层cs/hap复合支架可作为骨软骨组织工程支架,复合bmscs可修复兔关节软骨与骨缺损,重建关节解剖结构。

羟基磷灰石(ha)是骨组织中无机物的主要成分。利用丝胶蛋白(ss)良好的生物相容性、生物降解性、细胞相容性,以及含有的羧基和羟基能与ca2+紧密结合的特点,将氢氧化钙和磷酸以湿法合成的羟基磷灰石按一定的比例加入到浓缩后的丝胶蛋白溶液中,经冷冻干燥制备成丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料,期望用于骨替代和骨缺损修复。对丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料进行扫描电镜(sem)、x射线衍射(xrd)、红外吸收光谱(ftir)、热力学性能以及力学性能等检测,并探讨不同原料配比对材料结构与性能的影响。结果表明,丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的孔隙分散均匀,孔隙率33.0%～62.5%;支架材料中的ha呈弱结晶态,与人体骨组织中ha的晶体态相似,丝胶蛋白分子呈β折叠结构;随着复合支架材料中ha的比例不断增加,材料的热分解温度提高,热学性能改善,当ha的质量分数达到50%时,弹性模量增大到15.64mpa,呈现较好的结构性能。

目的关节软骨的病变常伴有软骨下骨缺损,其修复重建一直是骨科难题。探讨bmscs-双相支架复合物修复骨软骨缺损的可行性,比较其与植入单纯双相支架及动物自身修复效果的差别具有重要意义。方法以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolicacid,plga)、羟基磷灰石(hydroxyapatite,ha)为原料制备由软骨相和骨相构成的三维支架,提取天然ⅰ型胶原(collagentypeⅰ,colⅰ)涂于表面制成plga-ha-colⅰ双相支架。取新西兰乳兔骨髓分离培养获得的第2代bmscs,以1×106个/ml接种于双相支架,扫描电镜观察支架结构和细胞分布。取30只6月龄新西兰大白兔,建立股骨远端关节面骨软骨缺损模型,随机均分为3组,a、b组分别于缺损区植入单纯双相支架和bmscs-双相支架复合物,c组作为空白对照组未植入支架材料。于术后1、3、6、9个月取材行大体及组织学观察,术后9个月对a、b组标本行大体评分比较、microct扫描定量分析及免疫组织化学染色观察。结果扫描电镜示双相支架孔隙连通性好,软骨相和骨相孔径不同,bmscs在双相支架内生长良好。大体观察示术后9个月内a组关节表面逐渐形成类软骨样组织,部分出现塌陷或不规则缺损;b组关节面无塌陷或碎裂,新生组织质地更接近正常组织;c组缺损一直存在。大体评分显示3组修复效果比较差异均有统计学意义(p0.05)。组织学观察示术后1个月a、b组缺损区存在炎性反应;术后3个月新生组织长入;术后6个月支架完全降解,新生组织在植入物及缺损边缘爬行生长;术后9个月形成大量胶原纤维,表面多为纤维软骨。c组观察期内缺损持续存在。术后9个月免疫组织化学染色示a、b组标本缺损区colⅱ染色呈弱阳性,colⅰ染色阳性。结论plga-ha-colⅰ双相支架具备较适宜的一体化修复骨软骨缺损的物理特性,接种bmscs后整体修复效果更好。

目的制备和综合评价组织工程化骨替代材料并用于修复骨肿瘤所导致的骨缺损。方法制备狗和人的异体脱钙骨基质颗粒(dbm),提取牛骨形成蛋白(bbmp)并经成骨诱导活性测定,将bbmp与dbm用直接掺和的方法复合后,再与骨水泥(bc)混合制成组织工程化复合材料,进行综合评价后备用。56例下肢骨肿瘤患者在微波诱导高温原位灭活后,应用组织工程化复合材料对遗留的骨缺损进行修复重建。结果bbmp、dbm和bc组织工程化复合骨修复替代材料具有良好的生物相容性、很强的生物力学强度和成骨诱导活性,并且具有良好的粘合性和可塑形性。临床应用56例,经平均9个月的随访,效果良好且无任何不良反应。患肢膝关节功能评价,优52例(93%),良4例(7%),优良率100%。结论bbmp、dbm和bc组织工程化复合骨修复替代材料是目前修复骨缺损理想的产品,有广阔的临床应用前景。