正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以sds法提取的结缕草属植物叶片dna为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对影响结缕草属植物srap-pcr的mg2+、dntp、引物、taqdna聚合酶和模板dna五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对srap-pcr反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用l16(45)方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据4对引物对6份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,2种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析2种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物srap-pcr的最佳反应体系:mg2+2.00mmol/l、dntp220μmol/l、引物0.20μmol/l、taqdna聚合酶0.50u、模板dna60ng、2μl10×buffer,总体积为20μl。这一优化体系的建立为今后利用srap标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。

【目的】优化大旗瓣凤仙issr-pcr反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考。【方法】利用正交试验设计对大旗瓣凤仙issr-pcr反应体系的5个因素(mg2+、dntp、引物、taqdna聚合酶、模板dna)4水平进行优化分析,并在此基础上对pcr反应过程中的退火温度进行筛选。【结果】建立了大旗瓣凤仙issr-pcr的优化反应体系,即在25.0μl反应体系中含1×pcrbuffer、mg2+1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.8μmol/l、taqdna聚合酶0.75~1.00u、模板dna100ng。通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物。【结论】优化的issr-pcr反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的issr遗传多样性分析。

以假俭草为材料,对影响issr-pcr扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草issr-pcr分析的最佳反应体系。表明在20μl总体积中,包含40ng模板dna、issr引物0.4μmol/l、dntps0.1mmol/l、mg2+1.0mmol/l0、.1utaqdna聚合酶和10×buffer2.0μl。扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃延伸7min。

为了丰富柳树分子标记的手段,以旱柳salixmatsudana为材料,通过正交实验设计法,获得适于旱柳的相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,srap)-聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)体系;对srap-pcr扩增过程中的2次退火温度进行优化。结果如下:优化反应体系,25.00μl反应液中,含20.84nkat的taq酶,2.00μlmg2+(25.00mmol·l-1),2.50μl碱基混合物(脱氧核糖核苷酸dntps,各2.50mmol·l-1),1.50μl引物(20.00μmol·l-1),100.00ngdna模板,2.50μl10×taq酶缓冲液。扩增程序,94℃2.0min;94℃1.0min,38℃1.0min,72℃1.5min,5个循环;94℃1.0min,54℃1.0min,72℃1.5min,30个循环;72℃10.0min。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)检测,特征性条带清晰,信息量大,完全可以用于旱柳基因组的研究分析。

采用单因子试验与正交试验的方法,研究了海南龙血树(dracaenacambodianapierreexgagnep)issr-pcr反应体系中的主要影响因子,筛选出16条有效引物并优化了它们的退火温度,此外还检测了体系的重复性。优化后的25μl反应体系包含:10×pcrbuffer2.5μl,3.0mmol/lmgcl2,300μmol/ldntps,taq聚合酶3.0u,引物0.2μmol/l,dna模板20ng。该反应体系可用于海南龙血树的遗传多样性和遗传结构的分析。

比较ctab法和sds法提取叉叶苏铁(cycasmicholitzii)的总dna,发现ctab法是提取叉叶苏铁总dna的较好方法;对叉叶苏铁issr-pcr反应体系中的4个主要因素dntps,taqdna聚合酶,引物及mg2+进行最优条件筛选;采用单因素法探讨dna模板量、退火温度和循环次数的最佳反应条件,建立了适合于叉叶苏铁的最佳issr-pcr反应体系(20μl体系):1×buffer,75ngdna模板,dntps250μmol·l-1,taq酶1.0u,引物0.2μmol·l-1,mg2+2.5mmo·ll-1,反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸2min,循环40次,72℃延伸10min,4℃保存。本研究结果为苏铁纲植物的分子生物学和分子系统学研究提供理论参考。

以文心兰‘小樱桃’花梗腋芽诱导出的丛生芽为增殖培养材料,采用正交设计法,研究基本培养基、6-ba、naa和水解乳蛋白(lh)4种因素对文心兰丛生芽增殖的影响,以期筛选出各因子的最佳水平,建立文心兰‘小樱桃’丛生芽增殖培养体系。结果表明:各试验因素对文心兰丛生芽增殖影响的主次关系为6-ba>基本培养基>naa>lh;筛选出文心兰丛生芽增殖的最佳培养基配方为改良1号+6-ba3.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1+lh0.5g·l-1,45d平均增殖系数达6.53,有效提高了繁殖效率,为其种苗工程化育苗提供了技术基础。

斑潜蝇隶属双翅目(diptera)潜蝇科(agromyzidae)斑潜蝇属(liriomyza),是一类重要的农业害虫。近年来,随着海峡两岸果蔬贸易的快速发展,斑潜蝇类害虫传入大陆地区的风险明显增加,植物检疫部门急需该类害虫的快速鉴定技术和方法。本研究针对我国进境检疫性害虫三叶草斑潜蝇(l.trifolii),在检测和检索其线粒体dna细胞色素氧化酶i(mtdnacoi)基因序列并与其近缘种美洲斑潜蝇(l.sati-vae)和南美斑潜蝇(l.huidobrensis)相同基因序列比对的基础上,设计并筛选了其种类识别特异引物,初步实现了三叶草斑潜蝇的快速鉴定。

运用单因素试验法对影响也门铁issr-pcr扩增的各个因素进行了优化,优化体系为:25μl反应体系中,taq酶浓度0.04u.μl-1、dntps浓度0.18mmol.l-1、引物浓度0.4μmol.l-1、mg2+浓度2.0mmol.l-1、模板浓度0.8ng.μl-1、甲酰胺浓度1.6%、1×buffer,最后用ddh2o补足到25μl。利用优化体系和筛选的引物对也门铁及其嵌合体品种进行了issr扩增分析。

以sds法提取的结缕草(zoysiaspp.)叶片dna为模板,应用正交试验设计,从mg2+、dntp、引物和dna聚合酶并通过比较不同浓度的模板dna对pcr扩增的影响,确立结缕草属植物issr-pcr反应的最佳体系。结果表明:各因素不同浓度对pcr反应结果有显著影响,正交设计可以用于issr反应体系建立,该方法建立的结缕草属植物issr-pcr优化反应体系为10xbuffer7、0ng模板dna、mg2+2.0mmol.l-1、dntp150μmol.l-1、primer0.3μmol.l-1、taqdna聚合酶1.0u,总体积20μl;经对11份结缕草属植物进行检验,证明该体系稳定可靠。该体系的建立可为今后利用issr标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析等提供依据。

采用单因子试验和正交试验设计,对影响海南龙血树rapd-pcr反应的模板dna量、mg2+、dntp和引物浓度,taq聚合酶用量等因子进行研究,分析各因子对rapd-pcr扩增结果的影响,确立了海南龙血树rapd-pcr反应的最佳条件,即在25μl反应体系中,包含10×buffer2.5μl,2.0mmol/lmgcl2,300μmol/ldntps,taq酶1.5u,引物0.8μmol/l和dna模板20ng。以此条件为基础,筛选出适用于海南龙血树rapd-pcr分析的18条有效引物,为采用rapd技术分析海南龙血树种群遗传变异水平和遗传结构打下了基础。

分别采用单因子试验和正交设计试验对影响红花檵木rsap-pcr反应体系的5个因素(dna模板量、mg2+浓度、dntps浓度、引物浓度、taq酶量)在4个水平上进行优化.结果表明,2种方法得到的影响因素的最优水平存在差异,通过综合比较与分析,选取红花檵木rsap-pcr最优反应体系为:在25μl的反应体系中,模板量70ng,mg2+浓度1.50mmol/l,dntps浓度0.25mmol/l,引物浓度0.20mmol/l,taq酶量2.50u.

利用正交设计试验,对影响issr-pcr的mg2+、dntps、引物、taqdna聚合酶和模板dna5个因素进行优化试验。结果表明:25μlissr-pcr反应体系中各因素的最佳条件为mg2+2.5mmol/l、dntps0.25mmol/l、引物0.2μmol/l、taqdna聚合酶1.0u,模板dna40ng。通过对狗牙根issr-pcr最佳反应体系进行梯度退火试验,得到引物ubc881的最佳退火温度为50.5℃。该体系在24个狗牙根种质中获得较好的扩增结果,该优化体系为今后利用issr技术进行狗牙根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。

本文采用可见分光光度法,测定新疆农六师103团产网纹甜瓜子中总黄酮的含量。通过正交设计优选最佳提取工艺,结果可知,料液比5:1,温度为80℃,提取3次,每次3h时提取效果最好,总黄酮含量为8.52%,该方法简便,快速,可为后续开发提供一定理论基础。

以西洋杜鹃(rhododendronhybridum)叶片提取的基因组dna为材料,用引物ubc880(序列为ggagaggagaggaga)研究了pcr反应体系的主要成分及退火温度对该种植物issr扩增结果的影响。确立了可用于西洋杜鹃issr-pcr分析的最适宜的pcr反应体系:20μlpcr反应体积中,含10ng模板dna,0.25mmol.l-1dntps,2.0mmol.l-1mg2+,1.0utaqdna聚合酶,0.4μmol.l-1引物,并确定引物ubc880的最适退火温度为54.4℃。pcr扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,54.4℃退火45s,72℃延伸1.5min,共40个循环后,72℃延伸7min,4℃保存。应用该issr体系对11份西洋杜鹃种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增issr的pcr优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组dna为材料,系统地测试了模板dna、引物、dntps、mg2+浓度、taqdna聚合酶用量及退火温度对issr-pcr反应体系的影响。结果表明:优化的pcr反应体系为:20μl总体系中,含30ng模板dna,0.3μmol.l-1随机引物,0.2mmol.l-1dntps,1.4mmol.l-1mg2+,0.8utaqdna聚合酶;最佳退火温度为60℃;pcr反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,60℃退火45s,72℃延伸2min;45个循环;72℃再延伸7min。

issr标记能揭示出种间、种内遗传变异情况,更好地揭示亲缘关系和遗传多样性。以大花萱草的5个品种为试材,研究了影响大花萱草issr-pcr扩增效果的各项因素,建立了适合大花萱草issr-pcr的最佳反应体系:20μl反应体系中,10×buffer2μl,dntp0.2mmol/l,mg2+浓度1.5mmol/l,引物浓度0.5mmol/l,taq酶10.002nkat,dna模板20ng。大花萱草的最佳issr扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性40s,50℃退火45s,72℃延伸1.5min,共40个循环;最后72℃延伸10min。通过该反应程序进行的大花萱草issr扩增可获得清晰、稳定的条带。

[目的]建立贯叶连翘的issr-pcr反应体系,并对其条件进行优化。[方法]以贯叶连翘基因组dna为模板,用l16(45)正交试验设计系统分析引物浓度、taqdna聚合酶浓度、mg2+浓度、dntp浓度和模板dna浓度5种因素对贯叶连翘issr-pcr反应扩增结果的影响。[结果]正交试验设计的方法可以用于贯叶连翘issr-pcr反应体系的建立,经过优化得到贯叶连翘issr-pcr反应体系的最佳条件为:20μlissr-pcr反应体系中含10×pcrbuffer,mg2+浓度1.2mmol/l,taqdna聚合酶浓度50u/ml,dna浓度20ng/μl,dntp浓度250μmol/l,引物浓度0.75μmol/l。[结论]试验建立的贯叶连翘的issr-pcr反应体系重复性好、分辨率高,结果稳定可靠。

目的研究钟花报春花总黄酮最佳提取工艺条件。方法采用正交试验设计研究不同浓度的乙醇、溶媒体积和提取次数对钟花报春花总黄酮回流提取的影响;采用紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量。结果钟花报春花总黄酮最佳提取条件为60%乙醇,20倍量,提取3次。结论该方法简便、快速、准确,适用于该药材总黄酮的提取工艺研究。

目的优选野葛藤中异黄酮的提取工艺。方法以葛藤异黄酮得率为评价指标,通过正交试验设计优化葛藤异黄酮的提取工艺,并对最佳提取工艺进行工艺验证。结果葛藤异黄酮的最佳提取工艺为:乙醇浓度为50%,料液比1:20,超声提取时间30min,超声温度为20℃,异黄酮的提取率可达3.86%。结论采用正交试验设计优化对葛藤异黄酮提取条件进行优化合理可行。

采用单因子和正交设计2种方法,对影响广玉兰issr-pcr反应体系的5个因素(taq酶、mg2+、dntp、引模板dna)进行优化。结果表明:正交设计采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平与单因子试验找出影响因素最佳反应水平有一定差异,通过综合比较分析,最终建立了广玉兰issr-pcr的最佳反应体系:在20μl的反应体系中,taqdna聚合酶1.0u、mg2+1.2～1.5mmol/l、dntp1.80mmol/l、引物0.5～0.6μmol/l、30ng模板dna、10×pcrbuffer。同时,通过pcr比较,确定延伸时间为2min,循环次数为35个较为合适,确定了引物最佳退火温度,得到了广玉兰issr-pcr反应的最佳扩增程序。

采用单因子试验和正交设计方法,对影响阔叶十大功劳issr-pcr反应体系的引物、taqdna聚合酶、dntps、模板dna及退火温度5个因素进行优化,为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性奠定基础.结果表明:阔叶十大功劳issr-pcr的最佳反应体系为:在20μl反应体系中,0.5μmol/l引物、0.5utaq酶、150μmol/ldntps和20ng模板dna.在最佳反应条件下,从80条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的issr引物,并经过9份阔叶十大功劳种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点.综上所述,本文所建立的issr-pcr反应体系可用于阔叶十大功劳的种质鉴定及遗传多样性分析.