微藻代谢工程改造研究进展及展望

环境保护和能源供应是人类关心的两大问题。能源消耗释放出的温室气体对环境造成了严重影响。利用co_2固定途径可将co_2转化成燃料或化学品。天然固碳生物通常存在生长缓慢、固碳效率低等问题。通过在模式微生物中增强或重构co_2固定途径,实现co_2的再循环,可提高燃料或化学品的产量,减少温室气体排放。文中详细介绍了通过代谢工程手段改造co_2固定途径改善化学品生产以及糖合成,阐述了相关代谢途径及其中的关键酶在co_2固定中的作用,介绍了电生化合成系统的应用,显示出co_2固定的巨大潜力,并展望了未来co_2固定的研究方向。

l-乳酸是一种重要的有机化合物,具有广泛的应用价值。微生物发酵法生产是当前l-乳酸的主要来源,但受限于精确的发酵条件、菌体产物耐受能力低及底物要求高等因素,导致l-乳酸供给不足且价格偏高。鉴于酿酒酵母利用廉价底物生产有价值物质方面的诸多优势,并随着分子生物学技术的发展,利用代谢工程改造酿酒酵母本身固有的代谢网络,使其高产l-乳酸已成为当前研究的热点。从l-乳酸的异源生产、关键途径改造及菌体生长能力恢复三个方面归纳了关于代谢工程改造酿酒酵母生产l-乳酸的研究进展。最后,指出了酿酒酵母异源生产l-乳酸存在的不足和今后研究的方向。

乳酸是自然界中最小的手性分子,广泛应用于食品、医药和化工等领域,同时也是合成生物可降解塑料——聚乳酸的前体.目前,化学合成法和微生物发酵法是生产乳酸的两种主要方法,而后者在底物的可再生性、产物光学纯度和环境友好等方面均具有潜在优势.自然界中许多微生物细胞都能合成和积累乳酸,如大肠杆菌、酿酒酵母和乳酸菌等.与乳酸菌、芽胞乳杆菌和谷氨酸棒状杆菌等乳酸生产菌株相比,大肠杆菌具有生长速度快、营养要求简单、易于高密度发酵、代谢网络清楚、遗传操作方法成熟和产物乳酸光学纯度高等优势.本文中,笔者介绍了乳酸的研究现状及其在工业生产领域中的作用,系统综述了国内外通过代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展,在此基础上展望了乳酸生产研究的发展方向,以期为其工业应用提供参考.

芳香族化合物广泛应用于化学工业.利用代谢工程改造微生物生产各种芳香族化合物越来越受到人们的关注.通过理性改造,微生物可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物.此外,通过设计新的反应途径并引入外源基因,可以拓宽微生物生物合成的产物谱,获得某些具有重要应用价值的新的芳香族化合物.这些研究成果对解决化石能源危机和环境可持续发展问题具有积极意义.本文中,笔者主要对近年来微生物生产各种芳香族化合物的最新研究进展及相应的代谢工程改造策略进行综述,为开展相关研究提供参考.

多不饱和脂肪酸因其在食品和医药领域的广泛作用而得到人们极大的关注,当前利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸具有诸多优点,由于酵母生产迅速且生物量较高,利用酵母生产多不饱和脂肪酸已成为人们关注的热点。本文综述了代谢工程改造酵母生产多不饱和脂肪酸的研究进展,以常规酵母-酿酒酵母和非常规酵母-解脂耶氏酵母为例,介绍了酵母菌中多不饱和脂肪酸的代谢途径、酵母产油脂的生化机制、代谢工程改造酵母产多不饱和脂肪酸以及不饱和脂肪酸积累对酵母耐受性的影响。以后研究工作的重点是进一步加强对酵母生产多不饱和脂肪酸的机理研究,并以此为来指导代谢工程改造酵母生产多不饱和脂肪酸。

酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)作为"细胞动力车间"能够生产生物燃料和工业产品,2,3-丁二醇(2,3-bd)是其重要的一种次级代谢产物,广泛应用于工业化生产。但野生型s.cerevisiae合成2,3-bd的效率低,制约着工业化生产进程,因此,应用代谢工程法优化代谢途径来解决这一问题极其重要。该研究对近年来利用代谢工程手段来提高s.cerevisiae2,3-bd产量的策略进行了总结,主要包括:过表达2,3-bd合成途径中的关键酶编码基因；敲除编码乙醇、甘油、乙酸等分支途径的关键酶基因；利用可再生能源合成2,3-bd；应用辅因子工程手段对s.cerevisiae合成2,3-bd的代谢网络进行重新设计及合理改造等。对s.cerevisiae未来的研究方向进行了展望,为实现生物燃料2,3-bd的工业化生产提供了保障。

甘油是生物柴油的副产物,因其价格低廉和高还原性,成为生物发酵的重要碳源.为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力,从而提高萜类化合物的合成能力,本研究从β-胡萝卜素高产菌car015出发,对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控.首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glpr基因,然后分别用m1-37、m1-46和m1-93三个不同强度的人工调控元件对glpfk,glpd和tpia三组基因进行单基因调控和多基因组合调控.研究发现用m1-46调控glpd基因后p-胡萝卜素产量达到了64.82mg/l,是car015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100％;调控tpipa基因后β-胡萝卜素产量略有提高;调控glpfk基因后p-胡萝卜素产量略有降低.说明g1pd是甘油代谢途径中的关键限速步骤.q-pcr结果表明,降低甘油代谢途径的glpd和glpfk基因转录水平,增加tpia基因转录水平,可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量,可能是因为减少了丙酮醛毒性所致.组合调控glpd和tpia基因,获得β-胡萝卜素产量最高菌株gly003,其p-胡萝卜素产量达72.45mg/l,产率达18.65mg/g每克干细胞,分别是出发菌株car015的5.23倍和1.99倍.总之,glpd是甘油代谢途径中的关键限速步骤,适当强度调控glpd,可以有效提高重组大肠杆菌的p-胡萝卜素产量.

紫穗槐-4,11-二烯合酶催化fpp(farnesylpyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯,是青蒿素生物合成途径中的关键酶。本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述。紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆。紫穗槐-4,11-二烯合酶cdna全长1641bp,编码546aa。紫穗槐-4,11-二烯合酶最适ph范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高。在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,fpp首先进行的是1,6-合环,然后是1,10-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯。由于紫穗槐-4,11-二烯合酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入e.coli、s.cereviseae、烟草、拟南芥和a.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法。

目的:采用可以在运动发酵单胞菌中表达的操纵子构建重组运动发酵单胞菌,用于提高该细菌对高温高糖的耐受性和提高乙醇产量。方法:用外来的yfdz、metb和hsp构建的多顺反子质粒,转化运动发酵单胞菌而使其获得新的代谢途径。在玉米水解液中,验证了该多顺反子质粒对运动发酵单胞菌产生乙醇的影响。结果:与对照菌相比,在37℃和糖浓度为28%的培养条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到183.2%。在37℃,糖浓度为28%并添加氮源的条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到148.0%。结论:yfdz、metb及hsp三种基因的共同作用能显著提高运动发酵单胞菌的乙醇产量和发酵温度。

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母by4742中过表达甲羟戊酸（mva）途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶（hmgr）基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（ggps）基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（ggpp）的供给。在酿酒酵母底盘菌by4742-t2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中hmgr和ggps酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌bw02能生产1.56mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。

[目的]肌醇别名环己六醇,是一种具有生物活性的糖醇,在医药、食品和饲料等领域具有重要的应用价值.为获得生产肌醇的微生物细胞工厂,通过代谢工程改造,构建生产肌醇的酿酒酵母工程菌株.[方法]对酿酒酵母肌醇合成途径的正负调控同时改造,过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,敲除肌醇生物合成的转录抑制子基因opi1和抗性基因kanmx,获得重组菌.利用气相色谱法检测重组菌发酵液中肌醇含量.[结果]构建了生物安全性的产肌醇基因工程菌株,摇瓶培养产量为1.021g/l.[结论]通过过表达ino1和敲除opi1来改造酿酒酵母,能够有效提高重组菌的肌醇产量,为下一步的微生物发酵法产肌醇的工业应用奠定基础.

葡萄糖二酸是一种具有重要生物功能的有机酸,为了实现微生物合成葡萄糖二酸的高效生产,异源表达来源于小鼠基因组的miox基因及pseudomonasputidakt2440的udh基因,在毕赤酵母中构建葡萄糖二酸合成途径,实现了葡萄糖二酸的生成。通过在摇瓶水平进行优化,确定了最适碳源为葡萄糖(初始质量浓度60g/l最优),最适初始ph为5.5,最优接种龄为24h,最适接种体积分数为25%,重组毕赤酵母生成的葡萄糖二酸产量从最初的(566.36±16.98)mg/l提高至(967.60±3.90)mg/l。在此基础上,重组毕赤酵母在3l发酵罐中放大培养,葡萄糖二酸的产量达到了(2.60±0.04)g/l。

葡萄糖二酸是一种高附加值的有机酸,广泛用于食品、医药和化工领域.为获得生产葡萄糖二酸的微生物细胞工厂,通过共表达小鼠来源的肌醇加氧酶(miox)及恶臭假单胞菌来源的醛酸脱氢酶(udh),在酿酒酵母saccharomycescerevisiaecen.pk2-1c中构建了葡萄糖二酸合成途径,产量为(28.28±3.15)mg/l.在此基础上,通过调控前体肌醇的合成途径,发现肌醇-1-磷酸合成酶(ino1)是葡萄糖二酸合成途径的限速酶,过量表达ino1,葡萄糖二酸产量达到(107.51±10.87)mg/l,提高了2.8倍.进一步弱化竞争支路中磷酸果糖激酶(pfkl)的表达,最终葡萄糖二酸的产量达到(230.22±10.75)mg/l,为进一步获得高产葡萄糖二酸细胞工厂提供基础.

β-丙氨酸是天然存在的唯一一种β型氨基酸,在医药、食品、化工等领域有重要应用。该研究考察了以重组escherichiacoli发酵合成β-丙氨酸的可能性。在敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因的escherichiacolicicimb0016-050(acka-ptapflbadhefrdaldha)菌株中,考察叠加敲除β-丙氨酸的竞争途径天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(eⅱcbglc)的编码基因(lysc、panc、ptsg)以及过表达来源于corynebacteriumglutamicum的pand基因对合成β-丙氨酸的影响。结果表明,叠加敲除上述基因后,β-丙氨酸的合成量依次提高了12.5%、39.3%和13.3%;过量表达pand基因,β-丙氨酸合成量提高了86.2倍;经发酵条件优化,菌株b0016-080bb/ppl-pand摇瓶发酵可合成(5.0±0.2)g/lβ-丙氨酸,体积生产强度达到(0.12±0.01)g/(l·h)。该结果为发酵法合成β-丙氨酸奠定了基础。

以提高3-羟基丙酸的产量为目标,对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造,敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqhd,得到e.coliw3110δyqhd(pcdfduet-tac-gpd1-tukgsadh/pacycduet-tac-dhab1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53g/l,相比未敲除yqhd基因的菌株,产量提高了5.8倍。另外,敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpr基因,得到e.coliw3110δglpr(pcdfduet-tac-gpd1-tukgsadh/pacycduet-tac-dhab1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86g/l,相比未敲除glpr基因的菌株,产量提高了6.7倍。后经5l罐发酵培养后,3-羟基丙酸的产量提升到15.4g/l。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。

以选育的获得产l-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌md106为出发菌株,通过重叠延伸pcr及自杀载体介导的同源重组技术构建panbc及alat双基因缺失的突变株md106δpanbc/δalat,并对出发菌及双缺失重组菌进行摇瓶发酵试验,测定发酵指数。结果显示,发酵40h后,突变株的l-亮氨酸的产量为7.91g/l,比出发菌株提高43.3%,而且主要杂酸——丙氨酸减少超过80%,总杂酸比例较出发菌株减少55.6%。

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累l-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(afpyc)、苹果酸脱氢酶(afmdh)及c4-二羧酸转运蛋白(afmae),成功构建了l-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累l-苹果酸；(2)当共表达afpyc和afmdh时,菌株w005积累了1.93g/l的l-苹果酸,与对照菌株w004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%；(3)当共表达afpyc、afmdh和afmae时,菌株w006的l-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34g/l；4)通过提高接种量至初始od_(600)=2,l-苹果酸的产量提高到3.28g/l。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累l-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。

氨基酸作为一类营养物质在维持机体正常的生理生化反应方面具有重要的功能,常用作食品、药品和化妆品等的添加剂。氨基酸的生产主要依靠微生物发酵,产氨基酸菌的选育却是制约大规模工业生产氨基酸的重要因素。随着微生物分子育种技术的发展和运用,利用代谢工程改造细胞本身固有的代谢网络,指导氨基酸高产菌的选育已成为当前研究的热点。以谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)为例,就该菌株代谢网络的特征以及高产氨基酸的代谢工程策略和应用进行综述。

为了高效生产l-苹果酸,首先在大肠杆菌w3110中敲除ldha、poxb、pflb和pta-acka基因积累丙酮酸,为l-苹果酸合成提供前体,并且通过苹果酸酶的引入构建l-苹果酸一步合成路径,将丙酮酸转化为l-苹果酸.在此基础上,敲除frdbc、fumb和fumac阻断l-苹果酸代谢路径,并结合pos5基因的表达对胞内辅因子路径进行优化.结果表明:(1)ldha、poxb、pflb和pta-acka基因的敲除能有效地提高丙酮酸产量到20.9g/l;(2)苹果酸酶突变及过量表达使得l-苹果酸和琥珀酸产量分别提高了87.2%和31.6%,达到1.46g/l和3.25g/l;(3)通过敲除frdbc、fumb和fumac,l-苹果酸产量增加到3.42g/l;(4)pos5基因的表达降低了胞内nadh/nad+比率,增加了nadph含量,最终突变菌株escherichiacolif0921的l-苹果酸产量达到9.34g/l.因此,通过苹果酸酶构建l-苹果酸生物合成路径提高l-苹果酸的生产是可行的,结果可为代谢工程改造大肠杆菌生产l-苹果酸提供了新的研究思路.

植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一大类植物天然的次生代谢产物。d-柠檬烯属于单萜类化合物,由于它具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等多种功能,已被广泛应用于食品、香料、医疗等行业。目前d-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的,但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点。而本世纪初合成生物学技术的兴起,为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具,打破了物种间的界限,使微生物异源合成d-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成d-柠檬烯的微生物细胞工厂,实现微生物发酵法替换传统的植物提取法,具有重要的经济与社会效益。本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成萜类化合物取得的成就,阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物,利用代谢工程和合成生物学的手段构建高产d-柠檬烯的合成策略。

植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一大类植物天然的次生代谢产物.d-柠檬烯属于单萜类化合物,由于它具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等多种功能,已被广泛应用于食品、香料、医疗等行业.目前d-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的,但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点.而本世纪初合成生物学技术的兴起,为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具,打破了物种间的界限,使微生物异源合成d-柠檬烯成为现实.构建定向、高效的异源合成d-柠檬烯的微生物细胞工厂,实现微生物发酵法替换传统的植物提取法,具有重要的经济与社会效益.本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成萜类化合物取得的成就,阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物,利用代谢工程和合成生物学的手段构建高产d-柠檬烯的合成策略.

以选育低ph条件下高产l-乳酸的酵母菌为目的,从自然样品中筛选分离得到一株能在ph2.5(乳酸调节)的培养基中生长且不利用乳酸的酵母(初步鉴定为木兰假丝酵母candidamagnolia);进一步将来源于米根霉as3.819的乳酸脱氢酶编码基因(ldha)插入含有g418抗性基因的酵母穿梭载体,构建了重组质粒pyx212-kanmx-ldha,电转化入野生型c.magnolia中,筛选获得了一株具有产l-乳酸能力的重组菌株c.magnolia-2;通过发酵实验表明,该重组菌产l-乳酸的最适ph为3.5,并在ph2.5时正常发酵产乳酸。本研究成果为首次从自然界筛选到一株耐高浓乳酸的耐酸酵母菌,并以此为宿主菌构建了具有生产l-乳酸能力的耐酸重组酵母,为以耐酸酵母菌高产l-乳酸进行了有益的探索。