为了高效生产L-苹果酸,首先在大肠杆菌w3110中敲除ldh A、pox B、pfl B和pta-ack A基因积累丙酮酸,为L-苹果酸合成提供前体,并且通过苹果酸酶的引入构建L-苹果酸一步合成路径,将丙酮酸转化为L-苹果酸.在此基础上,敲除frd BC、fum B和fum AC阻断L-苹果酸代谢路径,并结合pos5基因的表达对胞内辅因子路径进行优化.结果表明:(1)ldh A、pox B、pfl B和pta-ack A基因的敲除能有效地提高丙酮酸产量到20.9 g/L;(2)苹果酸酶突变及过量表达使得L-苹果酸和琥珀酸产量分别提高了87.2%和31.6%,达到1.46 g/L和3.25 g/L;(3)通过敲除frd BC、fum B和fum AC,L-苹果酸产量增加到3.42 g/L;(4)pos5基因的表达降低了胞内NADH/NAD+比率,增加了NADPH含量,最终突变菌株Escherichia coli F0921的L-苹果酸产量达到9.34 g/L.因此,通过苹果酸酶构建L-苹果酸生物合成路径提高L-苹果酸的生产是可行的,结果可为代谢工程改造大肠杆菌生产L-苹果酸提供了新的研究思路.
为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累L-苹果酸；(2)当共表达Afpyc和Afmdh时,菌株W005积累了1.93 g/L的L-苹果酸,与对照菌株W004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%；(3)当共表达Afpyc、Afmdh和Afmae时,菌株W006的L-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34 g/L；4)通过提高接种量至初始OD_(600)=2,L-苹果酸的产量提高到3.28 g/L。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累L-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。
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