生物大分子的液_固色谱纯化过程中固相载体会产生产物吸附、变性等不良影响。高速逆流色谱无需固相载体 ,且具有高分便率和高回收率的优点 ,其中有机相 水相体系在分离天然产物中应用广泛 ,而应用双水相体系分离生物大分子尚处于研究阶段。双水相高速逆流色谱体系的建立与仪器设备及操作工艺条件密切相关 ,因此利用多分离柱高速逆流色谱仪 ,研究了PEG10 0 0_无机盐双水相体系对标准蛋白质混合物以及卵白蛋白的分离。pH值和PEG浓度对不同种类蛋白质的分配系数影响不同 ,实验发现在pH9 2的 15 0 % (W W)PEG10 0 0 17 0 % (W W)磷酸钾盐体系中 ,细胞色素C、溶菌酶和肌红蛋白的分配系数差异较大 ,且分布合理 ,因而采用该体系在 0 8mL min流速 ,85 0r min转速的条件下 ,成功分离了细胞色素C、溶菌酶和肌红蛋白的混合物。实验也发现在pH9 2的 16 0 % (W W)PEG10 0 0 17 0 % (W W)磷酸钾盐体系中 ,鸡蛋清样品中的主要蛋白质成分 :卵转铁蛋白、卵白蛋白和溶菌酶的分配系数差异最大 ,因而采用该体系在 1 8mL min流速、85 0r min转速的条件下 ,2 0 0min内从鸡蛋清样品中成功分离卵白蛋白 ,其电泳纯度为 10 0 % ,收率为 95 %。
目的探讨多聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达载体修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体联合丝素蛋白支架对新西兰大白兔软骨缺损的修复作用。方法培养兔源性BMSCs,流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表达。慢病毒Aggrecan过表达质粒转染BMSCs,超速离心法提取外泌体,Western Blot方法检测外泌体分子标志物CD81和CD63的表达。构建丝素蛋白支架联合外泌体复合物,利用扫描电镜技术检测丝蛋白支架的结构。利用苏木精-伊红(HE)染色和番红-快绿染色检测新西兰大白兔软骨缺损模型中软骨结构。结果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表达分别为60.2%和58.3%,CD34和CD45表达分别为3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan过表达载体转染效率为(95±2)%。扫描电镜观察显示,外泌体为直径40～100nm双层膜的膜状结构。Western Blot检测显示,外泌体可以表达分子标志物CD81和CD63。HE染色和番红-快绿染色结果显示,Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用明显优于BMSC组和阴性对照组(F=19.298、12.548,P<0.05)。结论 Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复具有明显的促进作用,可为骨性关节炎治疗提供新的思路与方法。
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